内皮祖细胞移植改善高氧暴露新生大鼠肺结构

摘要：目的 研究移植内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)对新生大鼠高氧肺损伤的影响及其机制. 方法 从4周龄Sprague-Dawyley大鼠骨髓中培养获取EPC并鉴定.另取新生Sprague-Dawley仔鼠60只,生后室温下适应性饲养24 h后,随机分为空气组、高氧组、移植组和Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-argininemethylester,L-NAME)干预组(简称干预组),每组15只.空气和高氧组分别在空气和85％高氧中饲养28d.移植组在85％高氧中暴露28d,其中在第21天尾静脉注射EPC 1×10 5个.干预组在移植组的基础上,自第21天开始连续腹腔注射L-NAME至第28天,每日剂量为20 mg/kg.第28天处死所有仔鼠,留取血标本,采用流式细胞技术检测CD34+细胞,酶联免疫吸附方法检测血清血管内皮细胞生长因子(vescular endothelial growth factor,VEGF).同时留取肺组织标本,观察辐射状肺泡计数和肺微血管计数、免疫荧光方法观察移植EPC在肺内的定植情况,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹技术检测肺组织中VEGF、VEGF受体(vescular endothelial growth factor receptor,VEGFR)2和内皮源性一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的表达,并用硝酸还原酶法检测肺组织中一氧化氮的表达.采用单因素方差分析和Bonferroni方法进行统计学分析. 结果 (1)培养所得细胞具有典型的EPC形态改变;结合异硫氢基荧光素标记荆豆凝集素-1并摄取Dil荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白的双阳性细胞约占总细胞数的85％;培养所得细胞中CD34+细胞含量为68.2％～72.4％.(2)空气组、高氧组、移植组和干预组仔鼠外周血CD34+细胞数量分别为(1.91±0.34)％、(1.06±0.10)％、(1.47±0.06)％和(0.77±0.11)％(F=32.710,P=0.000),高氧组低于空气组,移植组高于高氧组,干预组又低于移植组(P值均＜ 0.05).4组仔鼠血清VEGF水平分别为(7.90±2.72)、(6.38±0.72)、(14.00±1.66)和(11.70±1.91) pg/ml(F=22.809,P=0.000),移植组高于高氧组(P＜0.05).(3)移植的EPC在肺部主要定植于内皮下和肺泡间质.干预组定植的EPC明显少于移植组[分别为(16.95±0.50)个/视野与(10.70±0.47)个/视野,t=17.820,P=0.000].(4)4组仔鼠辐射状肺泡计数和肺组织微血管密度差异均有统计学意义(F值分别为859.580和211.150,P值均=0.000),其中高氧组RAC和微血管密度均小于空气组(分别为7.98±0.23与13.12±0.20,3.98±0.42与9.50±0.22,P值均＜0.05),移植组微血管密度为5.40±0.41,大于高氧组的3.98±0.42(P＜0.05).(5)高氧组肺组织VEGF mRNA表达量为0.23±0.16,低于空气组的1.05±0.33;移植组为0.69±0.09,高于高氧组;干预组为0.31±0.08,低于移植组(P值均＜0.05).高氧组肺组织VEGF蛋白表达低于空气组(分别为0.52±0.01与0.82±0.01),移植组为0.58±0.05,高于高氧组(P值均＜0.05).高氧组肺组织VEGFR2 mRNA表达低于空气组(分别为0.35±0.13与1.07±0.45,P＜0.05).高氧组肺组织eNOS mRNA表达低于空气组(分别为0.46±0.10与1.05±0.36,P＜0.05),eNOS蛋白表达亦低于空气组(分别为0.32±0.01与0.51±0.03),而移植组(0.86±0.02)高于高氧组(P值均＜ 0.05). 结论 外周静脉移植的EPC可以定植于肺组织中,改善高氧损伤的肺泡和肺血管发育,可能与上调肺组织eNOS和VEGF的表达有关.